Доктор биологических наук Сергей КОТЕЛЕВЦЕВ, ведущий научный сотрудник лаборатории физикохимии биомембран биологического факультета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

стр. 21

В современном мире практически нет экосистем, где бы отсутствовали загрязнители, в том числе и самые опасные. Так, сегодня неудивительно обнаружить пестициды, нацеленные на борьбу с вредителями растений, в жировых тканях китов или полихлорированные бифенилы (они используются в промышленности и очень токсичны даже в малых концентрациях) в молоке женщин с островов Тихого океана, т.е. за тысячи километров от мест их применения. Как же выявить присутствие подобного рода соединений и спрогнозировать последствия их воздействия на живой организм?

Разумеется, при этом не обойтись без химико-аналитических методов: они помогают выяснить не только "имя" токсиканта, его концентрацию, но и источник проникновения в окружающую среду, а потому служат основой эколого-токсикологического анализа. Не обойтись, конечно, и без привлечения других наук - генетики, молекулярной биологии. Все перечисленные подходы в последние десятилетия активно развиваются в ведущих научных центрах мира, в том числе в МГУ им. М. В. Ломоносова.

Вместе с коллегами с биологического факультета МГУ мне удалось в последние 25 лет поработать на Черном и Балтийском морях, озере Байкал, реке Волге, на Алтае, в районе аварии на Чернобыльской АЭС, а также в Норвегии, Финляндии, США. Для анализа воздействия экотоксикантов на биологические объекты различного уровня - от бактерий, одноклеточных водорослей до высших растений, рыб, птиц, млекопитающих и человека - использовали методы биотестирования и биоиндикации (к ним мы еще вернемся). Собирали образцы воды, донных отложений, тканей растений, животных и в нашей лаборатории физикохимии биомембран определяли активность ферментов, детоксицирующих ксенобиотики. Вместе с тем на химическом факультете МГУ в лаборатории доктора химических наук Альберта Лебедева выявляли в образцах концентрацию особо опасных загрязнителей. На кафедре генетики биологического факультета совместно с кандидатом биологических наук Вадимом Глазером изучали содержание в пробах мутагенов* и канцерогенов. Именно о них и пойдет речь далее.

НЕЗАМЕТНЫ, НО КОВАРНЫ

Мутагены наиболее разрушительны для экосистем, поскольку их влияние может проявляться и в последующих поколениях. Доказано, что 90% из них канцерогенны, вызывают злокачественные опухоли у животных и людей. Такими свойствами обладают некоторые тяжелые металлы (например, никель и хром) и множество органических соединений (полициклические ароматические углеводороды, полихлорированные бифенилы, хлорфенолы, некоторые амины и др.).

Впрочем, мутагенные соединения могут и не обладать острой токсичностью, но, накапливаясь в организме, проявляют продолжительное действие с особо опасными последствиями. Среди них различают химические вещества, реагирующие с ДНК непосредственно, и другие, требующие предварительных метаболических изменений или активации в клетке для проявления генотоксичности. Примерами пер-

* Мутагены - физические и химические факторы, вызывающие наследственные изменения - мутации (прим. ред.).

стр. 22

Накопление токсикантов по пищевым путям и индукция ферментов детоксикации.

вых служат эпоксиды, ароматические N-оксиды, нитрозамиды и т.д., вторых - ароматические углеводороды, ароматические амины и азотсодержащие соединения. Часто мутагенные соединения образуются при нефтепереработке.

Одна из характерных черт мутагенных и канцерогенных веществ - способность оказывать биологическое воздействие в очень низких концентрациях. Это затрудняет их аналитическое определение в тканях. С другой стороны, с помощью химических методов нельзя определить, какие вещества проявляют канцерогенное и мутагенное действие (хотя в последнее время под руководством доктора биологических наук Серикбая Абилева в московском Институте общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН разрабатывают математические методы, позволяющие по структуре соединения предсказать такие возможные его свойства). Окончательный же ответ дают только биологические тест-системы, приобретающие все большее значение и распространение. Однако, если, например, в США, тест Эймса (о нем мы скажем ниже) используют в сотнях лабораторий, то в России таких, к сожалению, не наберется и пяти.

Как и всякий ксенобиотик, мутаген претерпевает в организме ряд превращений. Условно их можно разделить на несколько этапов. В цитоплазме клетки он встречается со многими ферментными системами - они способны разрушить его молекулу и он утратит свои опасные свойства. Впрочем, часто возникает и противоположная ситуация, когда метаболиты данного ксенобиотика более мутагенны, чем исходное вещество. Этот процесс называется метаболической активацией (ниже о ней будет сказано подробнее).

В результате взаимодействия с хромосомами клетки мутаген вызывает в них потенциальные изменения - они либо реализуются в истинные мутации, либо их "залечивают" ферментные системы, следящие за постоянством структуры ДНК и "ремонтирующие" любые ее нарушения, возникающие как спонтанно, так и под влиянием внешних воздействий.

СИСТЕМА ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ

В процессе эволюции живые организмы выработали биохимические механизмы для борьбы с повреждающим действием ксенобиотиков (включая мутагены и канцерогены). Чужеродные вещества подвергаются биотрансформации в мембранных структурах эндоплазматической сети* клетки. Ферменты-монооксигеназы активируют молекулу кислорода, а затем один ее атом внедряют в молекулу окисляемого вещества, другой же идет на образование молекулы воды. Важнейший из упомянутых ферментов - цитохром Р-450. Ныне известно более ста его изоформ. Следует отметить, что большой вклад в изучение монооксигеназ внес академик РАМН Александр Арчаков, директор Института биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН (Москва)**.

Мембраны эндоплазматической сети, содержащие цитохром Р-450, сравнительно легко выделяются из

* Эндоплазматическая сеть - расположенная в цитоплазме система канальцев и пузырьков, ограниченных мембранами. Участвует в обменных процессах, обеспечивая транспорт веществ из окружающей среды в цитоплазму и между внутриклеточными структурами (прим. ред.).

** См.: А. Арчаков. Время протеомики. - Наука в России, 2009, N 3 (прим. ред.).

стр. 23

Доля проб, отобранных на побережье острова Хурное, проявивших мутагенный эффект:

1 - водоросли, полихеты;

2 - моллюски, ракообразные;

3 - мышцы трески;

4 - мышцы чаек;

5 - яйца чаек;

6 - ткани птенцов чаек.

гомогенатов тканей с помощью дифференциального центрифугирования. Полученный препарат носит название микросомной фракции, и именно в ней с помощью спектральных и иммунологических методов определяются концентрации изоформ данного фермента. На основании такого анализа можно косвенно узнать и о масштабе проникновения токсинов: чем выше обнаруженная концентрация цитохрома, тем, следовательно, активнее вела себя монооксигеназная система, нейтрализующая действие ксенобиотиков.

Однако кроме детоксикации, при монооксигеназном окислении происходит и метаболическая активация мутагенов. При этом в системе цитохрома Р-450, например, из бенз(а)пирена (сам по себе он не связывается с ДНК) после взаимодействия с ферментами в клетке получается около десяти изомеров, часть из которых приобретает мутагенные свойства.

Одна из основных характеристик рассматриваемой системы, особенно интенсивно развитой в клетках печени, - ее удивительная полиспецифичность, иными словами, способность быстро реагировать на проникновение в организм любого нового врага. Как бы ни старалась современная промышленность, выпускающая тысячи и тысячи соединений, на сегодня практически неизвестны гидрофобные химические вещества, присутствие которых в мембранах эндоплазматической сети не привело бы к их метаболической трансформации и к многократному увеличению активности монооксигеназ, перерабатывающих эти ксенобиотики.

Индукция (интенсивное ускорение синтеза специфических изоформ цитохрома Р-450) начинается с взаимодействия ксенобиотика со специфическими рецепторами на плазматической мембране. После этого сигнал передается в ядро и включаются специальные гены, ответственные за синтез соответствующего фермента. Поскольку этот процесс находится под генетическим контролем, изоформы отличаются друг от друга аминокислотной последовательностью. Одни из них образуются независимо от того, в каких условиях находится клетка, другие синтезируются в следовых количествах и достигают определенного уровня при наличии в организме эндогенных (образующихся в клетке) или экзогенных (поступающих извне) субстратов-индукторов.

Можно с уверенностью утверждать, что в клетках печени современного человека активность изоформ системы цитохрома Р-450 существенно выше, чем у наших дедушек и бабушек, поскольку они не сталкивались с современными лекарствами и с продуктами химической промышленности, в изобилии поступающими в окружающую среду в настоящее время.

Отметим, что активность монооксигеназного окисления выше в тканях человека и теплокровных животных, ниже - в тканях рыб, очень низка в растениях. Можно говорить и о соответствующей видовой специфичности этого процесса. Так, активность монооксигеназ гепатоцитов (клеток печени) птиц убывает в ряду: перепел > пустельга > голубь > цапля > чайка. Особенно низкий уровень цитохрома Р-450 (по сравнению со всеми другими рыбами) мы обнаружили у бычков-эндемиков на озере Байкал. Таким организмам труднее давать отпор проникающим из внешней среды токсинам, они менее устойчивы перед разрушительным их действием, накапливают их в своих тканях. Определение уровня цитохрома Р-450, точнее, определенных его изоформ, важно и для человека - различие в скорости наращивания этого фермента может способствовать увеличению риска онкологических и других заболеваний у людей, контактирующих с токсикантами на производстве, так как в результате монооксигеназного окисления происходит не только детоксикация, но и метаболическая активация мутагенов.

НАКОПЛЕНИЕ ТОКСИКАНТОВ ПО ПИЩЕВЫМ ПУТЯМ

Межвидовые отношения различных животных, особенно в простых экосистемах, достаточно адекватно описываются с помощью трофических (пищевых) цепей и построенных на этой основе "энергетических пирамид". Скажем, в тундре лишайник служит пищей для северных оленей, а те, в свою очередь, становятся добычей волков. Для тайги характерен другой ряд последовательностей, к примеру, растительность - заяц - рысь. Одна из наиболее простых и хорошо изученных последовательностей из-
стр. 24

вестна по океану: фитопланктон - криль - кит. Иной порядок характерен для озера Байкал: фитопланктон - эпишура (мелкие ракообразные) - бокоплавы (байкальские креветки) - бычки эндемики (в основном голомянка) - омуль - нерпа. Ну а вершиной любой пирамиды, как правило, являются хищники из числа птиц и млекопитающих.

Вместе с пищей, а также через покровные ткани из воды и воздуха загрязнители поступают в живые организмы. Но природа создала для них защитный механизм: практически все они имеют ферментативные системы, которые метаболизируют, связывают и выводят ксенобиотики из биологических тканей. Причем чем выше организация того или иного живого объекта, тем динамичнее у него идет детоксикация и метаболическая активация загрязнителей, активней вырабатываются ферменты, связывающие тяжелые металлы. Но все же липорастворимые, химически устойчивые соединения накапливаются по пищевым путям и, как правило, концентрация их от "этажа" к "этажу" пирамиды увеличивается: в тканях организмов, составляющих ее вершину, она значительно выше, чем в окружающей среде и у биологических объектов, находящихся в ее основании. Более того, устойчивое равновесие экосистемы может быть нарушено при избыточным давлении на нее токсиканта. При этом сначала нарушаются структуры, способные удалять ксенобиотики из тканей. Затем происходят сбои в физиологических функциях, размножении и, в конечном итоге, гибель или критическое сокращение численности популяции.

БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

Исследовать мутагенное действие загрязнителей окружающей среды на животных - длительный и трудоемкий процесс. Вот почему широкое распространение получили тесты на бактериях. Чаще всего в этих целях используют классические объекты генетики микроорганизмов - Bacillus subtilis, Eseherihia colt, Salmonella typhimurium. Все они быстро размножаются, что позволяет за считанные часы получить несколько поколений. Кроме того, современная генная инженерия создала ряд чувствительных штаммов микроорганизмов для выявления мутагенного действия загрязнителей даже в очень низких концентрациях. В числе достоинств метода отметим также экономичность и возможность учета мутаций различных типов. Однако указанные биотесты не лишены недостатков. Основной из них - отсутствие у бактерий ферментов, осуществляющих метаболи-
стр. 25

ческую активацию ксенобиотиков. В этих системах невозможно определять промутагены, так как в бактериальных клетках нет ферментативных систем, превращающих промутагены в мутагены.

Трудностей удалось избежать благодаря использованию аналогов таких систем - мембранных структур из печени млекопитающих или рыб, содержащих активные изоформы цитохрома Р-450, - микросомы*.

Подобный подход лежит и в основе теста, разработанного в 1974 г. американским ученым Брюсом Эймсом и имеющего сейчас широкое распространение. Запускаемое с помощью этого метода микросомное окисление по сути осуществляет те же процессы, что происходят и в самой печени животных. Для таких тест-систем были созданы специальные штаммы бактерий: они позволяют регистрировать одну или несколько мутаций ДНК, проявляющихся либо в заменах азотистых оснований, либо в сдвиге рамки считывания генетического кода, т.е. "незапланированной" вставке или, наоборот, выпадении нуклеотида.

А теперь остановимся на итогах нескольких наших работ с применением указанных методов в разных регионах мира. При исследовании в 1980-х годах рыб, обитающих в Байкале, мы редко обнаруживали мутагенные соединения. Однако в тканях нерпы, а также в яйцах птиц, гнездящихся в устье реки Селенга, впадающей в озеро, мутагенов, как правило, было много - химический анализ подтвердил наличие значительного количества не только полициклических, но и полихлорированных углеводородов, включая ДДТ. Причем в тканях взрослых животных загрязнителей оказалось больше, чем у молодых.

В первой половине 1990-х годов мы изучали активность ферментных систем детоксикации ксенобиотиков на примере лещей из Рыбинского водохранилища на реке Волге. С этой целью отлавливали их в разных участках, в том и числе и загрязненных стоками Череповецкого металлургического комбината (Вологодская область). Токсичность воды здесь была столь велика, что нарушалась структура мембран печени рыб, что приводило к снижению активности мембранно-связанных ферментов, а значит, и возможностей борьбы живых организмов с ксенобиотиком.

Еще одно наблюдение мы провели на острове Хурное в северной Норвегии в начале 2000-х годов. В пробах воды и в водорослях не было обнаружено (за единственным исключением) генотоксических соединений. Сколько-нибудь значительного накопления ксенобиотиков не выявили и в моллюсках, хотя обычно они являются сильными аккумуляторами экотоксинов, что определяется особенностями их образа жизни и обмена веществ. Экстракты тканей местных бокоплавов, напротив, проявили непрямой мутагенный эффект. А прямой обнаружили в мышцах мойвы, выловленной в прибрежных водах острова Хурное. В контрольной группе взрослых чаек (экстракты тканей мышц) в 10 из 11 проб зафиксирован прямой мутагенный эффект типа сдвига рамки считывания генетического кода. Но в шести из этих случаев метаболическая активация снижала или даже устраняла обнаруженный эффект. Таким образом, в начальных звеньях исследуемой пищевой цепи, как показали наши тесты, не происходит значительного накопления генотоксинов, однако в последующих за счет аккумуляции концентрация их возрастает.

Ранее подобные работы мы провели в 1990-х годах на озере Саимаа (центральная Финляндия) совместно с профессорами Пирья Линдстром-Сёппа и Осмо Ханнинен (Университет Куопио). Форель (по 10 однолетних самцов) помещали в садки в непосредственной близости от выброса сточных вод целлюлозно-бумажного комбината, а также на расстоянии 500, 1000, 5000 и 10 000 м от него. Достоверное увеличение монооксигеназной активности в печени рыб удавалось зафиксировать не только вблизи, но даже в 5 км от источника загрязнения. На основе полученных данных был сделан вывод, что на таком большом расстоянии от места стока водная система испытывает негативное влияние комбината, и предложена схема биохимического мониторинга в озерах Финляндии.

Очень высокую концентрацию мутагенных соединений мы обнаружили в 2007 г. в тканях птиц и рыб, обитающих в центральной части африканской реки Нигер. Это, по-видимому, связано со сбросом в окрестностях города Бамако (столица Республики Мали) сточных вод предприятия, выпускающего пластмассы, а также с применением тут пестицидов и гербицидов сельскохозяйственного назначения. Образцы для анализа передал в нашу лабораторию бывший выпускник Университета дружбы народов (Москва), кандидат биологических наук, профессор университета Бамако Витал Труаре. Работа выполнялась в рамках программы ЮНЕСКО.

В заключение хотелось бы подчеркнуть: изучение механизмов метаболизма и накопления загрязнителей, особенно обладающих мутагенными и канцерогенными свойствами, необходимо не только для охраны окружающей среды, но и для улучшения здоровья людей. Вот почему важно, чтобы исследования в этой области активно развивались, получали поддержку и в нашей стране.

* Микросомы - мембраны эндоплазматической сети клетки, выделяемые из предварительно гомогенизируемой печени. Это замкнутые пузырьки диаметром в несколько микрон, содержащие все ферменты указанной сети (прим. ред.).